近年来，由于分析仪器的不断发展和完善，用薄层扫描仪直接测定斑点的含量已成为薄层色谱定量的主要方法。薄层扫描仪是为适应薄层色谱的要求而专门对斑点进行扫描的一种分光光度计。该仪器种类很多，双波长薄层扫描仪（ｄｕａｌｗａｖｅｌｅｎｇｔｈＴＬＣｓｃａｎｎｅｒ）是目前较为常用的一种。例如，我国目前广为应用的日本岛津生产的CS930双波长薄层扫描仪、润扬仪器公司的KH-2100和KH-2300双波长薄层扫描仪便是其种类之一。
双波长薄层扫描仪的光学系统与双光束双波长分光光度计相似，其原理也相同。从光源Ｌ（氘灯、钨灯或氖灯）发射出的光，通过单色光器ＭＣ分成两束不同波长的光λ１和λ２。斩光器（ＣＨ）交替地遮断这两束光，蕞后合在同一光路上，通过狭缝，照射在薄板（Ｐ）上。如采用反射法测定，则斑点表面的反射光由光电倍增管（ＰＭＲ）接受，如采用透射法，则由光电倍增管（ＰＭＴ）所接受。光电倍增管将光能量转变为电讯号输出，再由对数放大器转换为吸收度信号，此信号由记录仪记录，即可得轮廓曲线或峰面积。
双波长扫描仪的光学系统其主要不同处是只有一个单色光器。它由主机（扫描仪）和数据处理机两部分构成。在进行测量时，仪器先自动转到预先设定的参比波长处测定，然后自动计算出两个波长的吸收度差值。该仪器自动化程度高，所有操作和测量参数都由操作者事先编好程序，然后由计算机自动控制。
两种波长的选择，通常是选择斑点中化合物的吸收峰波长λｍａｘ作为测定波长，选择化合物吸收光谱的基线部分、即化合物无吸收的波长λＲ作为参比波长。选择方法和双波长分光光度法选择波长的方法相同。因为双波长扫描法测定值是在λｍａｘ处扫描所得的吸收值减去在λＲ处的吸收值（即空白背景值），使薄层背景的不均匀性得到了补偿，曲线的基线较为平稳，测定的精度得到了改善。
扫描方式根据扫描光束的运动轨迹，一般可分为直线扫描和锯齿形扫描。
（１）直线扫描法光束以直线轨迹通过色斑。扫描光束应将整个色斑包括在内。测得的是光束在各个部分的吸收度之和。它适用于色斑外形规则的斑点。缺点是光束若从不同方向扫描，测得的吸收值将会不同。
（２）锯齿形扫描法光束呈锯齿状轨迹移动，这种扫描方式特别适用于外形不规则及大的斑点，优点是即使从不同方向进行扫描，亦能获得基本一致的积分值。
测定方式分为透射法、反射法和荧光测定法。
（１）透射法当一定波长的光束照射到薄层斑点上，光通过斑点而被部分吸收，另一部分透过薄层的光可由投射用的光电倍增管检测出来。该法只适用于透明薄板，故应用上受到一定限制。
（２）反射法光束照到薄层斑点上，部分光被斑点吸收，另一部分被反射的光可由反射测量用的光电倍增管检测出来。反射法受薄层表面均匀度影响较大，但对薄层厚度的均匀性要求不高，它适用于不透明薄板（如氧化铝、硅胶），是目前应用较多的测定方法。
（３）荧光测定法用汞灯或氖灯发出的光源作激发光照射到斑点上，然后用反射法或透射法的测定方式来测量斑点被激发后所产生的荧光。该法的特点是灵敏度高，适合于微量物质的含量测定。
（一）定性分析
薄板上斑点位置确定之后，便可计算出Ｒｆ值。然后，将该Ｒｆ值与文献记载的Ｒｆ值相比较来鉴定各组分。但由于影响Ｒｆ值的外因很多，如吸附剂的种类和活度、表面积、颗粒大小及水分的多少，展开剂的极性、蒸气的饱和程度，展开时的温度，展开方式、展开距离等因素都会给比移值带来不同程度的影响。因此要测定的条件与文献规定的条件完全一致比较困难。通常的方法使用对照法，即在同一块薄板上分别点上试样和对照品进行展开、定位。如果试样的Ｒｆ值与对照品的Ｒｆ值相同，即Ｒｓ值等于１，则可认为该组分与对照品为同一物质。有时为了可靠起见，还应采用多种不同的展开系统进行展开。如果，所得到的Ｒｆ值与对照品均一致，才可基本认定是同一物质。
（二）定量分析
薄层色谱法的定量分析采用仪器直接测定较为方便、准确。也可采用薄层分离后再洗脱，得到洗脱液用紫外分光光度法或其他仪器分析法进行定量。也还有其他一些简易定量或半定量的方法。
１．目视比较法
将对照品配成浓度已知的系列标准溶液，同样品溶液一起分别点在同一薄板上展开，显色后，目视比较样品色斑的颜色深度和面积大小与对照品中哪一个蕞为接近，即可求出样品含量的近似值。该法的精度为±１０％，适合于半定量分析或药物中杂质的限度检查。
２．斑点洗脱法
将样品液以线状点在薄板的起始线上，展开后，用一块稍窄一点的玻璃板盖着薄板的中间，用以上定位方法定位出薄板两边斑点。拿开玻璃板将待测组分斑点中间条状部分的吸附剂定量取下（如采用刀片刮下或补集器收集），用合适的溶剂将待测组分定量洗脱，然后再按照比色法或分光光度法测定其含量。
3．斑点面积测量法
面积法是根据薄层板上斑点面积与物质浓度的关系，直接进行含量测定的一种方法。实验结果表明。斑占样品质量的对数(1gm)与斑点面积的平方根．屑成线性关系．
(1)稀释未知样品法 在同一块薄层板上，点3个样品点：标准样品点，未知浓度样品点，稀释到一定倍数的未知样品点。正常展开显色后，测量相应斑点面积(相对值)。
(2)稀释标准溶液法 在同一块薄层板上点3个样品点：标准样品点，稀释到一定倍的标准样品点，未知浓度样品点。正常展开显色后，测量相应的斑点面积(相对值)，优为所求未知物质量。
斑点面积的测量可采用一张半透明的绘图纸，覆盖在薄层上，描出斑点的面积，再将纸移到方格坐标纸上，读出斑点所占的格数，测量每格的面积(约0.25cm×0.25cm)，即司计算出斑点的总面积。误差为±5％。
4．扫描光密度法
扫描光密度法是直接用仪器在薄层板上测定斑点的颜色深度或荧光强度的一种方法。由于它的分离效率和测定灵敏度高、准确、快速，现已成为薄层定量的主要方法。薄层扫描定量方法可分为吸收测定法和荧光测定法。吸收测定法又可分为透射法和反射法。透射法是使光束照到薄层斑点上，测量透射光强度；反射法是使光束照到薄层斑点上，测量反射光的强度。凡被测组分有荧光或经适当处理后能生成荧光化合物时，均可进行荧光测定。可用氙灯或汞灯作紫外光源，测定时可选择适宜的激发光和荧光波长。
