液相色谱仪分析柱安装、活化平衡、再生与反冲 关键问题必看!

液相色谱仪分析柱安装、活化平衡、再生与反冲 关键问题必看!

日期:2020-8-20

色谱柱技术始于上世纪50年代,随着填料和填充技术的发展,色谱柱技术日益成熟,功能也日趋完善,目前已被广泛应用于生命科学、环保、材料、食品、药物开发等领域。

液相色谱柱在色谱分析系统中主要起着分离检测物质的作用,如同色谱系统的心脏,同时也是易损耗品。

为了减少损耗,色谱柱的使用维护至关重要!液相色谱柱使用过程常用问题包括色谱柱连接、色谱柱活化、色谱柱使用、色谱柱维护、色谱柱保存等。

1、色谱柱连接

色谱柱安装方向

色谱柱安装应按照同一个方向连接使用,且需要按照色谱柱上的方向指示连接,尽量避免色谱柱反向连接!

常见色谱柱连接的问题主要有两种,安装色谱柱时管线伸出接头长度过长,使得螺纹拧入较浅,会导致密封性不好而漏液,进一步引起基线漂移或响应降低;反之,会在管线前段出现死体积,引起峰形展宽,灵敏度降低。

理想的接头连接应具备以下特性:管线与接口之间无死体积;在超高压和高温下始终避免泄漏;优异的长期使用稳定性,防止管线滑动;简便易用。

管线的选择也非常重要,分析型液相系统蕞常用的规格是0.12和0.17mm内径的管线。更换管线时首先要确认当前管线的规格、并更换相同内径和长度的管线,否则会造成更换前后结果的不一致,因为管线体积会影响系统柱外体积,从而影响峰形和保留时间。

2、反相柱活化平衡

1) 首先,使用甲醇或乙腈冲洗约20 倍柱体积 。

2)若流动相含有缓冲盐,使用与流动相中初始比例相等比例的超纯水和有机相冲洗过渡约20 倍柱体积,再用含缓冲盐的流动相平衡冲洗约20 倍柱体积或以上。

3) 若流动相不含缓冲盐,可直接用流动相平衡色谱柱,大约20 倍柱体积或以上。

4)当基线和压力平稳后测试,判断是否充分平衡以连续进样结果的重现为准。若不够可延长流动相的平衡时间。

3、反相柱冲洗保存

1)使用50:50 甲醇或乙腈与水的混合溶液冲洗20-30 倍的柱体积;

2)使用纯甲醇或乙腈冲洗20-30倍柱体积;

3)储存之前将堵头紧紧密封在柱端接头上,以免填料变干。

4、反相色谱柱清洗再生

清洗或反冲清洗反相色谱柱时,用以下溶剂至少各30倍柱体积冲洗色谱柱:

断开色谱柱与检测器的连接,将管线留在色谱柱末端,将其放入接收液体的烧杯中,先用不含缓冲液盐的流动相冲洗(水/有机相),然后用 100% 有机相(甲醇和乙腈)冲洗,检查压力是否回归正常,如果没有,再进行下一步操作。

如压力没有回归正常,丢弃色谱柱或考虑用更强的条件清洗:75% 乙腈/25% 异丙醇、100% 异丙醇、100% 二氯甲烷 、100% 己烷。

值得注意的是,无论是使用己烷还是二氯甲烷,使用之前或恢复使用反相流动相之前必须用异丙醇进行冲洗。

关于色谱柱反冲

虽然色谱柱不应轻易反冲,但当明确知道超压来自颗粒物堵塞筛板或柱头污染时,反冲是蕞有效补救方法。反冲色谱柱可使颗粒物快速被冲出,此外还可快速冲出柱头强吸附污染物,柱子反冲后蕞好仍然正向连接使用。不过,反冲也会带来负面影响,如可能导致柱床松动、发生保留时间改变、小粒径的色谱柱反冲可能导致填料流出等。

其中,可以反冲的色谱柱有:粒径大于2um的色谱柱(2.7、3、3.5、4、5μm等);而不可反冲的色谱柱有:粒径小于2um的色谱柱(1.8μm RRHD/RRHT;1.9μm Poroshell)。

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