在液相色谱仪分析中,根据流动相和固定相相对极性的不同,可分为正相色谱和反相色谱。所谓正相色谱是指固定相极性大于流动相极性的情况,反之,固定相的极性小于流动相的极性,则称为反相色谱。
正相色谱与反相色谱的区别是什么呢?由于极性化合物更容易被极性固定相所保留,所以正相色谱系统一般适用于分离极性化合物,极性小的组分先流出。相反,反相色谱系统一般适用于分离非极性或弱极性化合物,极性大的组分先流出。因此在应用上,正相色谱用于分离极性较大的物质,如蛋白质、生物碱等。反相色谱多用于分离极性较小的物质,在流动相的选择上,反相色谱的优势更大,在实际工作中反相色谱的应用更为广泛。
正相色谱用的固定相通常为硅胶,以及其他具有极性官能团,如胺基团和氰基团的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基或其他团的极性较强,因此,分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小,即极性强弱的组份先被冲洗出色谱柱。
反相色谱填料常是以硅胶为基础,表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色色谱所使用的流动相极性较强,通常为水,缓冲液与甲醇,已腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合先被冲出,而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有C18、C8、C4、C6H5等。
反相液相色谱柱效高、分离能力强、保留机理清楚,是液相色谱分离模式中使用蕞为广泛的一种,对于生物大分子、蛋白质及酶的分离分析,反相液相色谱正受到越来越多的关注.反相色谱法是以表面非极性载体为固定相,以比固定相极性强的溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式。反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团,基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离。在生物大分子分离中,多采用离子强度较低的酸性水溶液,添加一定量乙腈、异丙醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作流动相。普通的反相色谱固定相和孔径大于300Å的硅胶键合烷基固定相应用较为普遍,聚合物基质的反相色谱固定相也有较多应用。
在分析实验中需将反相色谱切换正相色谱的方法如下:
1、先将色谱柱用相应的溶剂冲洗干净,然后将色谱柱拆下来密封保存。用双通将进样器与检测器连接;
2、将贮液瓶内装入300ml的二次蒸馏水,将流速渐次提高到2.0ml/min冲洗系统1.5h。注意观察泵压;
3、将流速渐次降到0ml/min,把二次蒸馏水更换为甲醇,将流速渐次提高到2.0ml/min冲洗系统1h;
4、用同样的方法将甲醇更换为异丙醇、四氢呋喃,各冲系统1h;
5、再后将四氢呋喃更换为预先配制好的流动相冲系统1h,同时将柱塞杆清洗系统内的10%异丙醇更换为流动相,保持50-60滴/min的速度清洗柱塞杆。再将双通更换为正相色谱柱,待液相色谱仪色谱柱平衡好以后就可分析样品了。